До настоящего времени основным методом определения активности трипсина был метод Эрлангера в модификации Шатерникова. Недостатками данного метода является его большая стоимость, погрешность связанная с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности стандартного раствора р-нитроанилина от его концентрации используемого для построения калибровочного графика, сложность расчетов.

Целью нашей работы являлось устранение вышеизложенных недостатков существующей методики.

Нами разработан микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях.

Метод основан на расщеплении трипсином синтетиче­ского бесцветного субстрата — бензоиларгинин-р-нитроанилида — с образованием окрашенного р-нитроанилина, количество которого мы определяем на спектрофотометре BACKMAN-DU65 c микрокюветами при длине волны 410 нм.

Реактивы используемые в нашем методе такие, как и в методике Эрлангера в модификации Шатерника.

Калибровка проводится по описанной методике отличием является построение графика, которое проводится для автоматизации процесса и ведения базы данных в Microsoft Excel.

Поскольку калибровочный график не может иметь четкую линейную зависимость, то для выражения зависимости оптической плотности раствора от концентрации р-нитроанилина необходимо определить уравнение которое описывает данную график. Таким уравнением является уравнение полиномиальной аппроксимации, которое можно также вывести на калибровочный график в Microsoft Excel.

Ход определения:

В опытную и контрольную пробирку вносят по 0,4 мл бензоиларгинин-р-нитроанилида и добавляют по 0,025 мл физиологического раствора. Затем вносят по 0,025 мл плазмы крови, в контрольную пробирку сразу после этого добавляют 0,05мл 0,5н раствора НCl. 0,5 мл содержимого помещают в микрокювету и измеряют значение оптической плотности при длине волны 410 нм и обозначают это значение, как ЕК(410). Поскольку в некоторых случаях в ходе ферментативной реакции происходит помутнение раствора, для введения поправки на мутность следует определить оптическую плотность жидкости также и при длине волны 550 нм. Полученные данные помечают как ЕК(550). Далее опытную пробирку ставят в термостат при температуре 370С на 30 минут. После термостатирования определяют оптическую плотность раствора при длинах волн 410 и 550 нм в опытной пробирке и помечают полученные данные, как ЕОп(410) и ЕОп(550).

Расчет активности трипсина производят в три этапа

1. Расчет разницы оптических плотностей при разных длинах волн, она будет равна:

DЕ = (ЕОп(410) – ЕК(410)) – (ЕОп(550)- ЕК(550))

2. Расчет количества образовавшегося р-нитроанилина по полиномиальному уравнению, которое в общем виде будет выглядеть следующим образом:

y = b + c1*x + c2*x2 +……. +c6*x6 , где b и с константы

Пример полиномиального уравнения для расчета концентрации р-нитроанилина: y = 874,45*x 1 + 84,94*x2

В данном случае константа b равняется 0 и в связи с этим опущена. х - DЕ, а у – количество образовавшегося р-нитроанилина.

В каждой лаборатории должна быть проведена калибровка и расчет полиномиального уравнения для данных этой калибровки.

3. Непосредственно расчет активности трипсина.

Поскольку это микровариант методики определения трипсина, количества реактивов и плазмы крови пропорционально уменьшены по отношению к классической методике, то и коэффициенты перерасчета будут теми же, что и в классической методике.

Количество р-нитроанилина высчитанное с помощью полиномиального уравнения, показывает сколько вещества образовалось в ходе ферментативной реакции в 0,5 мл субстрата в течение 30 минут при добавлении 0,025 плазмы, а высчитываемое количество трипсина в единицах активности показывает сколько вещества образуется в 0,5 мл субстрата при добавлении 0,1 мл плазмы за 1минуту.

Следовательно А – количество трипсина в единицах активности будет равно: А = (у * 4) / 30.

Таким образом расчет активности трипсина по данной методике значительно снижает расход реактивов (в 10 раз по сравнению с методикой Эрлангера в модификации Шатерникова) очевидна экономическая эффективность первой из них. В связи с отсутствием принципиальных отличий между двумя методиками, результаты измерений активности трипсина будут аналогичными (разница между результатами будет находится в области погрешности методики). Немаловажным является и снижение количества забираемой крови на исследование. Так по предложенной нами методике плазмы необходимо всего 0,05 мл. а по классической методике 0,5 мл. Использование автоматических микропипеток позволяет уменьшить погрешность связанную с работой с микроколичествами реактивов и биологических материалов. Еще одним положительным моментом нашей модификации является упрощение расчетов и построения калибровочного графика и их автоматизация. Использование уравнения полиномиальной аппроксимации позволяет снизить погрешность методики связанную с нелинейностью зависимости изменения оптической плотности раствора р-нитроанилина от его концентрации. В целом методика расчета более проста для понимания, чем классическая, а использование Microsoft Excel позволяет не только полностью автоматизировать расчет, но и вести базу данных.

Алехин С.А., Липатов В.А. Микрометод определения активности трипсина в биологических жидкостях. // Материалы 66-й научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные проблемы медицины и фармации", Курск, 2001, -с. 57 - 59.